Лекция 12. Современные рекомендации по установлению референтных интервалов

М.И.Прищепа, кандидат технических наук, ЗАО «АНАЛИТИКА»

Важное предисловие. Данная лекция завершает тематический цикл по практической метрологии. Изначально планировалось, что все 12 лекций появятся на веб-сайте ЗАО «АНАЛИТИКА» в течение 12-13 месяцев с момента публикации первой из них. Таковы были планы. К сожалению, всё сделать в обозначенный срок не удалось. По разным причинам. Завершающая цикл, 12 по счету лекция публикуется только сейчас, в июне 2026 года. Но, как говорится, лучше поздно, чем никогда.

Тематика лекций цикла касается не только вопросов практической метрологии, возникающих при проведении количественных лабораторных исследований. Отчасти в лекциях уделялось внимание и современным подходам к клинической интерпретации лабораторных результатов, включая алгоритмы сравнения их между собой. В рамках непосредственно тематики практической метрологии в лекциях были рассмотрены технологии определения измерительных характеристик аналитических систем (АС) при их запуске в эксплуатацию и проверки соответствия этих характеристик установленным нормам. Кроме того, были рассмотрены возможные способы улучшения аналитических характеристик (АХ), вводимых в эксплуатацию или уже используемых АС, в случае возникновения такой необходимости. Достаточно много внимания было также уделено современным методам контроля стабильности АХ, причем как АС в процессе их эксплуатации, так и целиком аналитических методов, включая преаналитический этап. В том числе была предложена методология детекции случаев существенного изменения АХ в режиме реального времени. При выборе тематик лекций предполагалось, что рассматриваемые в них вопросы и даваемые рекомендации будут в той или иной степени помогать сотрудникам лабораторий быстрее находить оптимальные практические решения метрологических задач, часто возникающих при организации и проведении рутинных исследований. Что в конечном счете повысит и надежность клинической интерпретации лабораторных результатов.

Как известно, надежность такой интерпретации обуславливается не только измерительными качествами используемых АС, но в не меньшей мере и адекватностью референтных интервалов, используемых лабораторией. Главным образом их адекватностью контингенту, который обследуется в конкретной клинике. Обычно в лабораториях не особо обращают на это внимание и используют в своей практике референтные интервалы, взятые либо из справочников, либо из пользовательских инструкций изготовителей наборов реагентов. Но накопленный в лабораторной диагностике опыт показал, что такой способ установления референтных интервалов может приводить зачастую к ошибочной интерпретации получаемых лабораторных результатов. Именно по этой причине, видимо, и появились рекомендации ведущих организаций по стандартизации клинических лабораторных исследований об обязательной перепроверке лабораториями своих референтных интервалов на предмет их соответствия обследуемому контингенту. Вопросам установления адекватных популяционных референтных интервалов и будет посвящена первая часть данной лекции 12.

Особо отметим, что в последние годы в некоторых зарубежных клиниках наряду с общепринятыми популяционными начали использовать и так называемые персонифицированные референтные интервалы, получаемые на базе данных обследования конкретных индивидуумов. Такая практическая возможность появилась почти у всех лабораторий после того, как в специализированных периодических изданиях были опубликованы статьи, посвященные практическому определению и использованию персонифицированных референтных интервалов. О современных рекомендациях по установлению таких интервалов как раз и пойдет речь во второй части данной 12 лекции.

Для удобства поиска тех или иных вопросов по практической метрологии ниже перечислена тематика всех 12 лекций, размещенных на специализированном веб-ресурсе ЗАО «АНАЛИТИКА».

1. Введение в практическую метрологию лабораторных исследований.

2. Аналитические системы и их аналитические характеристики.

3. Технологии определения аналитических характеристик аналитических систем.

4. Современные требования к аналитическим характеристикам аналитических систем и их градации.

5. Алгоритмы проверки соответствия аналитических характеристик установленным нормам.

6. Технологии улучшения рабочих значений аналитических характеристик аналитических систем.

7. Управление качеством калибровки аналитических систем.

8. Традиционные технологии мониторинга стабильности аналитических характеристик аналитических систем.

9. Современные технологии детекции изменений аналитических характеристик.

10. Алгоритмы сравнения результатов лабораторных исследований.

11. Метрологическое обеспечение количественных лабораторных исследований.

12. Современные рекомендации по установлению референтных интервалов.

В данной 12 заключительной лекции цикла, вернее в ее первой части, будут рассматриваться современные общепринятые рекомендации по установлению, переносу и проверке правильности популяционных референтных интервалов, изложенные в международном и национальном стандартах [1, 2]. Как известно, такие референтные интервалы (далее они будут называться групповыми референтными интервалами и обозначаться аббревиатурой ГРИ) определяются либо на основе данных обследования представителей референтных групп, либо источником референтных значений служит массив данных обследования пациентов, накопленный в медицинских или лабораторных информационных системах. Решение всех задач по установлению «правильных» ГРИ для контингента, обследуемого в той или иной лаборатории, возлагается непосредственно на нее саму. Это, видимо, связано с тем, что именно лаборатории несут ответственность за предоставление клиницистам максимально точных и адекватных референтных интервалов, то есть должным образом проверенных в том числе на соответствие обслуживаемым ими популяциям. Как будет показано далее, наличие у лабораторий адекватных референтных интервалов – это очень важная составная часть обеспечения надежности клинической интерпретации получаемых ими результатов. По всей видимости, именно поэтому в пункте 7.3.5. национального стандарта [2], который определяет качество и компетентность медицинских лабораторий, указывается, что биологические референтные интервалы, используемые лабораторией, должны в обязательном порядке проверяться каждый раз, когда происходит изменение аналитической и/или преаналитической процедуры на предмет их соответствия популяции, обследуемой конкретной лабораторией. Не говоря уже о том, что это всегда необходимо делать, когда лаборатория предполагает использовать в своей практике референтный интервал, установленный не в ней. И даже в случае, если она собирается использовать АС, аналогичную той, которая использовалась при установлении такого референтного интервала. То есть так или иначе лаборатория должна убедиться, что ее собственная, находящаяся в здоровом состоянии популяция, и та референтная популяция, на базе которой был ранее установлен референтный интервал, подобны, насколько это возможно. И этот факт должен быть проверен лабораторией до введения в практику референтного интервала, установленного не в ней. С этой целью лаборатория вполне может воспользоваться правилами по переносу и проверке ГРИ, изложенными в общепризнанном во всем мире руководстве [1], разработанном Институтом клинических лабораторных стандартов (CLSI) совместно с рабочей группой Международной федерации по клинической химии (IFCC). Или, как более корректно пишут, что в разработке этих рекомендаций участвовала совместная рабочая группа CLSI и IFCC [7]. Многие известные эксперты в области лабораторной медицины полагают, что рекомендации руководства [1] представляют собой в настоящее время единственный наиболее авторитетный источник для персонала лабораторий, ставящих перед собой цель установить или перепроверить правильность выбора референтных интервалов для своих аналитических методов и/или обслуживаемых популяций.

Вскользь ещё раз упомянем, что помимо рассмотрения в первой части этой лекции вопросов установления ГРИ, определяемых на основе результатов обследования представителей референтных групп, во второй ее части речь пойдет об уже реализуемых на практике технологиях определения границ индивидуальных (персонифицированных) референтных интервалов, которые устанавливаются непосредственно на базе персональных данных индивидуумов [3, 4].

Особо отметим, что важность наличия у клиницистов, как заказчиков лабораторных исследований, адекватных референтных интервалов трудно переоценить, поскольку при первичном обследовании пациентов лабораторные результаты сравниваются обычно и прежде всего именно с такими интервалами, вернее с их пределами. И не важно групповые это референтные интервалы или персонифицированные. В настоящее время, как общеизвестно, наиболее широко используемыми инструментами для интерпретации лабораторных результатов пациентов все еще являются ГРИ. Клиническая ценность этих результатов в решающей степени будет зависеть от правильности установления референтных интервалов, вернее от правильности установления референтных пределов, с которыми собственно лабораторные результаты и сравниваются. И все усилия, направленные на обеспечение должной аналитической точности лабораторных результатов, в большей или меньшей степени будут напрасны, если референтные пределы были установлены лабораторией неверно или недостаточно точно. В сущности, такие референтные пределы представляют собой некие базисные точки отсчета, позволяющие клиницистам судить о том, находится ли полученный лабораторный результат обследуемого пациента внутри или за пределами, так сказать, «нормы». Или же для точного ответа потребуется дальнейшее обследование пациента.

Напомним, что референтный интервал для того или иного лабораторного показателя (далее – аналита) определяется в официальных документах [1, 2] как специфицированный интервал распределения значений, полученных при обследовании референтной популяции. Под таким специфицированным интервалом подразумевают центральный интервал, в который попадают 95% значений результатов обследования представителей референтной группы. И таким образом, 2,5% всех измеренных референтных значений будут оказываться за пределами нижней границы этого интервала, а другие 2,5% – за пределами его верхней границы, причем независимо от вида их распределения. Как станет ясно из дальнейшего, определяемые таким образом ГРИ характеризуют именно межиндивидуальную биологическую вариацию уровней аналитов в некоей референтной популяции, в связи с чем обладают некими ограничениями в интерпретации лабораторных результатов для обследуемых пациентов, особенно для аналитов с низким уровнем индивидуальности.

Это, конечно, не очень хорошо, что 5% результатов обследования здоровой референтной популяции (по 2,5% с каждой из сторон референтного распределения) отбрасываются при установлении референтных интервалов. Но, как говорится, ничего тут не поделаешь. Статистический подход есть статистический подход. Но именно в этой связи некоторые ведущие специалисты по лабораторной диагностике [11] полагают, что уже настало время начинать давать специальные хотя бы базовые знания студентам медикам по теории референтных интервалов. По крайней мере, следует в обязательном порядке доводить до их сведения, что внутри референтных пределов находятся только 95% результатов обследования референтной популяции. Это – во-первых. И, во-вторых, что рекомендуемые лабораториями значения для референтных пределов никоим образом не являются абсолютно точными. Для каждого такого значения имеется свой доверительный интервал. И, наконец, в-третьих, что неопределенность (погрешность) лабораторных результатов и данных по аналитическим и биологическим вариациям может значимо влиять на клиническую интерпретацию первых. Иначе говоря, будущие клиницисты в обязательном порядке должны усвоить, что нельзя лабораторные результаты и референтные пределы понимать как истину в последней инстанции.

Помимо сказанного выше следует также иметь ввиду, что хотя ГРИ и отражают определенные свойства здоровой популяции, но они не могут служить полноценным критерием суждения о здоровье или патологии конкретных индивидуумов. Сейчас для принятия решения об отнесении пациента к здоровым или больным принято использовать так называемые пороговые клинические значения (далее – ПКЗ), под которыми подразумевают, как это определяется, например, в стандарте [5], некие числовые значения уровня аналита, принятые группой экспертов в качестве критерия наличия или отсутствия существенных сдвигов в состоянии внутренней среды обследуемого пациента. Отмечается также, что пределы референтных интервалов для тех или иных аналитов могут очень часто не совпадать с их ПКЗ. Отсюда следует, что сравнение лабораторных результатов именно с ПКЗ представляется наиболее объективным основанием для принятия решений об оценке состояния пациента и о применении к нему тех или иных лечебных мер. Хотя клиническая практика показывает, что превышение текущего лабораторного результата над его пороговым значением в общем случае может иметь отношение к нескольким нозологиям. Именно поэтому в целях более точной диагностики клинических состояний пациентов для некоторых тестов в стандарте [5] рекомендуют устанавливать не одно, а несколько пороговых значений.

Заметим, что наряду с термином референтный интервал в литературе по лабораторной диагностике достаточно часто используется также термин референтный диапазон. Но поскольку референтные пределы по своей сути – это некие статистические значения, определяющие интервалы между наименьшим и наибольшим значениями уровня аналита, то многие национальные и международные организации по лабораторной медицине, в том числе и Международная федерация по клинической химии (IFCC), предпочитают использовать выражение референтный интервал, а не диапазон. В этой связи, в данной лекции мы также будем использовать термин референтный интервал.

Где-то полвека тому назад референтные интервалы и вовсе называли нормальными диапазонами или просто «нормами». Для получения ответа на вопрос о том, является ли текущий лабораторный результат «нормальным» или нет, его просто сравнивали с такими нормами, полученными путем обследования более-менее здорового контингента. Что было в то время вполне логично. Затем эксперты в области лабораторной медицины пришли к выводу, что термин нормальный диапазон не очень уместен, поскольку далеко не все, кто находился за его пределами, являлись «ненормальными». В смысле, нездоровыми. И наоборот – пациенты с определенными заболеваниями, то есть не вполне «нормальные», порой попадали в такой, как тогда называли, нормальный диапазон. Периодически предпринимались разнообразные попытки как-то решить эту проблему, но дать четкое определение термину «норма» достаточно долго не удавалось. И только в 1969 году взамен расплывчатому понятию «нормы» R. Grasbeck и N.-E. Saris [6] предложили термины «референтное значение» и «референтный диапазон», что впоследствии постепенно привело к современным представлениям о групповых референтных интервалах.

В какой-то момент развития лабораторной диагностики, с целью внедрения в нее научной строгости, потребовалось четкое и недвусмысленное определение терминов для концепции референтных интервалов. И в 1986 году после долгих экспертных обсуждений и консультаций Международная федерация клинической химии (IFCC) согласовала базовый набор определений [12], которые перечисляются ниже. Они и сегодня в основе теории и практики референтных интервалов.

(1) РЕФЕРЕНТНЫЙ ИНДИВИДУУМ – это индивидуум, выбранный для сравнения с использованием определенных критериев.

(2) РЕФЕРЕНТНАЯ ПОПУЛЯЦИЯ состоит из всех возможных для конкретных условий выбора референтных индивидуумов, число которых в этой связи заранее неизвестно.

(3) РЕФЕРЕНТНАЯ ГРУППА – это адекватное число референтных индивидуумов, взятых для представления референтной популяции. В идеале они должны быть случайным образом взяты из этой референтной популяции.

(4) РЕФЕРЕНТНОЕ ЗНАЧЕНИЕ – это значение (результат лабораторного теста), полученное путем наблюдения или измерения определенной величины у индивидуума, принадлежащего к референтной выборочной группе. Не путать с референтным пределом (см. ниже).

(5) РЕФЕРЕНТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ – это статистическое распределение референтных значений. Гипотезы относительно референтного распределения таких значений целиком в самой референтной популяции можно проверить с помощью распределения референтных значений в выборочной группе и соответствующих статистических критериев. Параметры гипотетического распределения референтных значений в референтной популяции также можно оценивать с помощью параметров их распределения в референтной группе и соответствующих статистических методов.

(6) РЕФЕРЕНТНЫЙ ПРЕДЕЛ – выводится из референтного распределения и используется в описательных целях. Обычно референтный предел определяется так, чтобы задаваемая доля референтных значений была меньше или равна верхнему пределу или же больше или равна нижнему пределу. Референтный предел описывает только референтные значения и не должен путаться с термином «пороговое клиническое значение» (ПКЗ).

(7) РЕФЕРЕНТНЫЙ ИНТЕРВАЛ – это интервал между двумя референтными пределами, включая их. Термин «референтный диапазон» был, как было упомянуто ранее, отклонен экспертным сообществом, поскольку, строго (статистически) говоря, диапазон – это разница между самым высоким и самым низким значением в наборе чисел, то есть это как бы одно значение.

(8) НАБЛЮДАЕМОЕ ЗНАЧЕНИЕ (результат теста пациента) – это значение определенного типа величины, полученное путем наблюдения или измерения и предназначенное для принятия медицинского решения. Его можно сравнить с референтными значениями, референтными распределениями, референтными пределами или референтными интервалами.

Следующая слегка откорректированная схема из документа [1], на наш взгляд, весьма удачным и логичным образом демонстрирует взаимосвязь между этими терминами: РЕФЕРЕНТНЫЕ ИНДИВИДУУМЫ (1) формируют РЕФРЕНТНУЮ ПОПУЛЯЦИЮ (2), из которой выбирается РЕФЕРЕНТНАЯ ГРУППА (3), на базе которой определяются РЕФЕРЕНТНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ (4), обуславливающие вид РЕФЕРЕНТНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ (5), с учетом которого вычисляются РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ (6), которые, в свою очередь, и описывают РЕФЕРЕНТНЫЕ ИНТЕРВАЛЫ (7), с которыми, в конечном итоге, и сравнивают НАБЛЮДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ (8).

Наиболее полно основные этапы развития концепции референтных интервалов с описанием уже решенных и еще нерешенных до сих пор проблем, изложены в работе [7]. В ней же перечислены основные преимущества и недочеты современной теории и практики использования референтных значений (далее – РЗ). В том числе в этой работе отмечается в качестве одного из основных преимуществ, что концепция референтных интервалов применима для всех количественных лабораторных исследований. То есть считается, что это очень и очень хорошо. И считается весьма плохим то обстоятельство, что нельзя результаты всех лабораторных тестов интерпретировать одним и тем же образом. Дело в том, что опыт клинического использования ГРИ показал, что они для некоторых аналитов оказались слишком широкими, а точнее сказать – размытыми. Главным образом вследствие чрезмерной их биологической вариабельности у представителей здорового контингента. В этой связи ГРИ для некоторых аналитов начали определять с учетом пола, возраста, расы и других параметров. Но и после такого разделения оказалось, что клиницисты так и не могут использовать полученные таким образом ГРИ, то есть даже с разделением их по полу, возрасту и расе, для всех пациентов в полном объеме. И, скорее всего, именно поэтому в последнее десятилетие в периодических изданиях по тематике лабораторной медицины начали появляться статьи с рекомендациями как определять и использовать на практике индивидуальные референтные интервалы. Наряду с общепринятыми групповыми референтными интервалами.

Основной теоретической предпосылкой для формирования понятий референтных интервалов как индивидуальных, так и групповых следует, по всей видимости, считать природную необходимость поддержания индивидуумами гомеостаза для выживания и нормального функционирования их организмов. Причем как правило в достаточно узких пределах. Что обусловлено тем, что во многих случаях даже не очень значительные отклонения от точки гомеостаза параметров внутренней среды организма могут приводить к болезням и даже к смерти. В этой связи организм каждого здорового индивидуума стремится удерживать – главным образом за счет отрицательных обратных связей – в том числе и уровень каждого аналита вблизи определенной равновесной точки, которую, собственно, и называют гомеостатической точкой (далее – ГСТ) или точкой гомеостаза. Но вследствие того, что условия жизнедеятельности организма индивидуума не являются стабильными и постоянно изменяются, то и реальные значения уровней аналитов также изменяются со временем в определенных пределах, концентрируясь вокруг своих точек равновесия. Если что-то выходит за пределы нормы, организм человека активирует соответствующие ответные реакции для восстановления баланса. Скорее всего, уровень аналита, соответствующий ГСТ, также как и диапазон его динамического изменения, у каждого индивидуума достаточно уникальные. Поскольку и все люди, с точки зрения своей биологии, тоже достаточно уникальные. Конечно, этот вопрос, как и некоторые другие, потребует дальнейшего более детального рассмотрения и изучения в будущем. Пока же никаких баз данных о расположении персональных ГСТ, по крайней мере, к моменту написания этой лекции, все еще нет в наличии, а распределение уровней конкретных аналитов вокруг ГСТ у здоровых индивидуумов сейчас принято описывать с помощью коэффициентов внутри-индивидуальной CV_i и межиндивидуальной CV_g биологических вариаций. Значения для показателей CV_i и CV_g для большинства исследуемых в лабораториях аналитов приведены, например, в приложении Б стандарта [8]. Но наиболее точные значения для этих показателей и описание методов их получения можно найти на сайте Европейской федерации по лабораторной медицине (EFLM) [9]. Сейчас именно EFLM официально поддерживает базу данных по биологическим вариациям уровней аналитов, в том числе постоянно занимаясь их уточнением.

С этой целью или сама Федерация проводит экспериментальные исследования по сбору необходимых данных, или это делают организации, которым поручает работы EFLM. В любом случае, такие исследования включают выбор референтной группы здоровых индивидуумов, сбор биопроб через регулярные интервалы времени с повышенным контролем этапов проведения преаналитической фазы. Пробы затем анализируются двукратно или многократно, чтобы можно было в последствии оценивать также и аналитическую вариабельность получаемых результатов в виде коэффициента аналитической вариации CV_a. Полученные экспериментально результаты измерений уровней аналита анализируются на наличие среди них выбросов, на наличие трендов и на однородность. После чего, используя традиционные методы статистической обработки данных, вычисляются значения для показателей CV_i, CV_g и СV_a. Здесь и далее указательные индексы i, g и a при перечисленных коэффициентах вариации не имеют никакого отношения к суммированию переменных, а просто указывают на принадлежность этих показателей к внутрииндивидуальной, межиндивидуальной и аналитической вариациям.

Следует особо отметить, что и для определения показателя CV_i, и для определения показателя CV_g специалистами EFLM используется референтная группа здоровых индивидуумов. Причем при определении показателя CV_i полученные данные по каждому индивидууму из обследуемой группы усредняются специальным образом по методологии EFLM, а именно с учетом их статистических весов в такой группе. Чем чаще встречаются близкие результаты обследования индивидуумов, тем выше будет их статистический вес. Также специалистами EFLM особо отмечается тот факт, что если показатель CV_i характеризует – хотя и усредненно – вариабельность уровня исследуемого аналита у конкретного здорового индивидуума также и во времени, то показатель CV_g описывает только вариабельность уровня исследуемого аналита между здоровыми индивидуумами выбираемой референтной группы.

Таким образом, значения для показателей CV_i и CV_g, которые принято выражать в долях или в % от измеряемого уровня аналита, определяются или уточняются по данным обследования отобранной специальным образом референтной группы практически здоровых индивидуумов. С последующим объединением всех результатов измерения уровней аналитов, полученных в процессе обследования. Но в случае определения значений для показателя CV_i делается это без учета времени забора биопроб у участников. Поэтому следует иметь ввиду, что, скорее всего, представленные на сайте EFLM значения для показателей CV_i и CV_g характеризуют не общую единую ситуацию для любого здорового индивидуума или для любых контингентов здоровых индивидуумов, а только для тех вполне конкретных, с которыми имели дело исследователи. Иначе говоря, эти значения дают только некоторое общее представление о порядке величины этих показателей. Вопросы о том, насколько сильно будут различаться между собой, во-первых, уровни аналита, соответствующие персональным ГСТ для разных здоровых индивидов, во-вторых, персональные значения CV_i для разных здоровых индивидуумов, и, наконец, в-третьих, групповые ГСТ, усреднённые по разным референтным группам, являются, скорее всего, тоже предметом дальнейших исследований. Не зря же в документе [1] весьма настойчиво рекомендуется каждой лаборатории уточнять границы референтных интервалов для своего контингента.

Сейчас же еще раз отметим, что выход за пределы ГРИ результатов измерений уровня аналита у обследуемого пациента, в общем и целом, принято считать признаком патологии. Но, как показал клинический опыт, универсальность такого подхода может быть ограничена особенностями индивидуальных свойств аналитов. Так, например, для аналитов с относительно небольшой внутрииндивидуальной биологической вариацией их содержания вероятность выхода патологических результатов за популяционные референтные пределы значительно меньше, чем для аналитов с относительно большой внутрииндивидуальной вариацией. Как упоминалось в обзорной Лекции 6 этого цикла, такие особенности аналитов можно охарактеризовать количественно с помощью индекса индивидуальности II, который для конкретного аналита рассчитывается как отношение его коэффициентов внутрииндивидуальной и межиндивидуальной вариаций, а именно:

где СV_i – коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации; CV_g – коэффициент межиндивидуальной биологической вариации уровня аналита. Из формулы (12.1) следует, что диагностическая чувствительность теста тем выше, чем больше у исследуемого аналита значение индекса индивидуальности II, то есть чем ближе значение CV_i к значению CV_g. И хотя баз данных о расположении персональных ГСТ в настоящее время все еще нет никаких, тем не менее, отметим, что наличие баз данных по CV_i и CV_g на сайте EFLM [9] является достаточно хорошей основой для возможности проведения лабораториями предварительных оценок многих важных и полезных показателей, в том числе не только для оценки значений индекса индивидуальности II, но также и для оценки значений нижнего и верхнего пределов индивидуальных и групповых референтных интервалов. Ниже приводится возможный алгоритм расчета таких оценочных значений. Он достаточно простой с точки зрения производимых вычислений, но желающим его использовать потребуется дополнительно провести некоторое количество измерений уровня аналита в пробах своих условно здоровых пациентов. Заметим также, что с целью максимального упрощения проведения расчетов в данной оценочной модели предполагается, что все используемые в ней результаты измерений уровня аналита распределяются по закону Гаусса симметричным образом относительно либо персональной, либо некоторой усреднённой по обследованным индивидуумам ГСТ. И, кроме того, предполагается, что коэффициенты преаналитической и аналитической вариаций малы по сравнению с биологическими вариациями как это часто бывает на практике, причем настолько, что ими в нижеприводимых расчетах можно пренебречь. При таком предположении верхние и нижние пределы индивидуального и группового референтных интервалов для конкретного аналита, в который попадают 95% его значений для k-того здорового индивидуума или референтной совокупности представителей здоровой популяции, обслуживаемой лабораторией, тогда можно будет приблизительно оценивать по следующим формулам:

В этих формулах Пверхik и Пнижik – значения верхнего и нижнего пределов индивидуального референтного интервала, определяемого для k-того индивидуума, при проведении оценочного расчета которых используется внутрииндивидуальный коэффициент биологической вариации CV_i в виде стандартного отклонения SDik, в свою очередь вычисляемого по формуле SDik = Агстk*CVi/100. Значение для показателя Z определяется выбором уровня доверительной вероятности и для 95% уровня доверия его значение будет равно 1,96. Соответственно Агстk – это экспериментальная оценка уровня аналита в ГСТ k-того индивидуума, вычисляемая по формуле Агстk = (ΣAjk)/n = (А1k+А2k+…+Аnk)/n, где значения А1k,А2k,…,Аnk – это результаты измерений уровня аналита в n пробах k-того условно здорового индивидуума после вычета выбросов при их наличии, и, наконец, индекс суммирования j изменяется от 1 до n, т.е. j=1,2,3,…,n–2,n–1,n. Соответственно Пверхg и Пнижg – значения верхнего и нижнего пределов группового референтного интервала, при проведении оценочного расчета которых используется межиндивидуальный коэффициент биологической вариации CV_g в виде стандартного отклонения SD_g, в свою очередь вычисляемого по формуле SD_g = Агстg*CV_g/100. Показатель Агстg – это усреднённая оценка уровня аналита в ГСТ группы обследуемых лабораторией условно здоровых индивидуумов, вычисляемая по формуле:

Агстg = (ΣAm)/p = (А1+А2+…+Аp)/p, где А1,А2,…,Аp – результаты измерений уровня аналита в референтной группе из p индивидуумов за вычетом выбросов при их наличии, и, наконец, индекс суммирования m изменяется от 1 до p, то есть m = 1,2,3,…,p–2,p–1,p.

Весьма желательно, чтобы значения n и p были не менее 20, хотя для совсем приблизительных оценок можно ограничиться и меньшим числом n и p, равным 10, например. Вполне понятно, что данные по результатам измерения уровня аналита в референтной группе могут предоставить только или непосредственно сами испытатели, или же их должна получить/накопить сама лаборатория, желающая хоть приблизительно оценить пределы индивидуального и/или группового референтного интервала для своего контингента практически здоровых индивидуумов. Напомним еще раз, что результаты измерений в каждом случае сначала надо проверить на наличие выбросов. Проще всего для этого воспользоваться методом Диксона/Рида. Метод Диксона/Рида для выявления выбросов основан на соотношении показателей D и R, где D – абсолютная разница между самым экстремальным значением набора данных (т.е. возможным выбросом) и следующим за ним по экстремальности значением; R – абсолютная разница между самым большим и самым маленьким значением из всех полученных. Если D равно или больше одной трети диапазона R, то самое экстремальное значение является выбросом. И наоборот. Проверку наличия выбросов среди остающихся результатов следует повторять до тех пор, пока критерий не покажет их отсутствие.

Чтобы привести пример вычисления оценок референтных пределов по вышеприведенным формулам предположим, что после проведения лабораторией измерений уровня глюкозы в 20 биопробах k-того обследуемого условно здорового пациента среднее по ним значение Асредk (после их проверки на наличие среди них выбросов) составило величину Асредk = 5,0 ммоль/л, что весьма близко к реалиям. И пусть после проведения лабораторией измерений уровня глюкозы в 20 биопробах обследуемых условно здоровых пациентов лаборатории среднее по ним значение Асредg (после их проверки на наличие среди них выбросов) составило величину Асредg = 4,7 ммоль/л, что также близко к реалиям. Из базы данных для коэффициентов внутрииндивидуальной и межиндивидуальной биологических вариаций на сайте EFLM [9] находим, что показатели CV_i и CV_g для глюкозы в плазме соответственно равны CV_i = 4,7%, а CV_g = 8,0%. Воспользуемся формулами (12.2)-(12.5) и тогда получим для нижних и верхних пределов индивидуального и группового референтного интервала следующие приблизительные значения:

Пверхik = Агстk+1,96*SDik = Aсредk+1,96*Асредk*CV_i/100 = 5,0+1,96*5,0*0,047 = 5,5 ммоль/л

Пнижik = Агстk–Z*SDik = Асредk–1,96*Асредk*CV_i/100 = 5,0–1,96*5,0*0,047 = 4,5 ммоль/л

Пверхg = Агстg+Z*SDg = Aсредg+1,96*Aсредg*CV_g/100 = 4,8+1,96*4,8*0,08 = 5,6 ммоль/л

Пнижg = Агстg–Z*SDg = Асредg–1,96*Aсредg*CV_g/100 = 4,8–1,96*4,8*0,08 = 4,0 ммоль/л

Отметим, что проведенная выше приблизительная оценка ГРИ (4,0-5,6) ммоль/л оказалась достаточно близкой к общепринятым в мире референтным интервалам для глюкозы в плазме, которые в США и в ЕС обычно равны (3,9-5,5) ммоль/л, в России – (4,1-5,9) ммоль/л, а по данным ВОЗ – (3,9-5,6) ммоль/л.

Заметим, что еще совсем недавно все вопросы определения референтных интервалов были исключительной прерогативой экспертных групп лабораторного сообщества. И сотрудники клинических лабораторий, хотя и осознавали важность наличия референтных интервалов, рассматривали их определение как довольно загадочную тему, которую, возможно, лучше оставить экспертам. Теперь же регулирующие органы, по крайней мере в США и в странах Западной Европы, требуют, чтобы сотрудники лабораторий занимались этой темой более активным образом. Лаборатории теперь должны или самостоятельно устанавливать ГРИ для собственного использования, либо с этой же целью переносить и верифицировать референтные интервалы, ранее установленные кем-то другим. Более не считается приемлемым просто брать и использовать в своей лабораторной практике референтный интервал, предлагаемый инструкцией набора реагентов или опубликованный в справочнике, без тщательной его перепроверки на предмет допустимости его использования для обслуживаемой лабораторией популяции.

Теперь, наконец, перейдем к описанию устоявшихся правил определения пределов ГРИ. Они описаны как в международном руководстве [1], так и в отечественном стандарте [5]. Но все же наиболее полно терминология и методология установления лабораторией группового референтного интервала либо самостоятельно, так сказать, с нуля, либо путем переноса ранее кем-то определенного ГРИ с подтверждением его соответствия обследуемой популяции, приведены в признанном во всем мире руководстве CLSI [1]. Заметим, что краткую выдержку из руководства [1] на русском языке можно найти, например, в работе [10].

Авторы руководства [1] прекрасно отдавали себе отчет в том, насколько сложно будет лабораториям самостоятельно и, так сказать, с нуля определять свои референтные интервалы. Чтобы продемонстрировать степень такой сложности, далее будут вкратце описаны основные процедуры по самостоятельному определению референтных интервалов, как это рекомендуется делать в этом руководстве. Понимая, сколь трудно будет для большинства лабораторий самим все это реализовывать, авторы нашли более целесообразное решение: они предложили гораздо более простой подход к установлению лабораториями собственных ГРИ, а именно путем переноса уже установленных ранее (или самой лабораторией для выводимого из эксплуатации старого аналитического метода, или кем-то еще для нового аналитического метода, вводимого лабораторией в эксплуатацию) референтных интервалов с последующей перепроверкой правильности и адекватности переноса. И это действительно хороший подход к решению такой непростой задачи. Тем не менее, следует особо отметить, что помимо перечисления многих ограничений на использование такого подхода, в руководстве [1] также предполагается, что переносимый референтный интервал должен быть верифицирован, то есть проверен на правильность перенесения его пределов для нового аналитического метода, вводимого в эксплуатацию в той же лаборатории, или для обследуемого лабораторией контингента, если она собирается использовать в своей практике референтный интервал, установленный ранее не в ней. При этом лаборатория должна также убедиться, что этот установленный не ею интервал был, в свою очередь, тоже установлен в соответствии с общепринятыми правилами.

Так или иначе, при переносе референтного интервала, установленного не самой лабораторией, она должна проанализировать следующее:

– демографические данные референтных индивидуумов, которые были включены в референтную популяцию при определении референтного интервала, включая возраст, пол, этническую принадлежность;

– критерии включения/исключения референтных индивидуумов при формировании референтной группы;

– размер референтной группы;

– преаналитические и аналитические процедуры для получения РЗ;

– метод вычисления пределов референтного интервала на базе полученных РЗ.

Теперь вкратце рассмотрим необходимые условия для возможности переноса в лабораторию уже установленных ранее не ею референтных интервалов, а также последовательность действий при таком переносе, как это рекомендуется делать в руководстве [1]. По мнению авторов руководства, имеются только две наиболее важные причины, которые могут влиять на референтные пределы. Это, во-первых, используемый лабораторией аналитический метод и, во-вторых, обслуживаемая лабораторией популяция. Отсюда следует, что эти рекомендации по переносу могут применяться и в случае, когда лаборатория собирается использовать в своей практике установленный кем-то еще референтный интервал, и в случае, когда лаборатория заменяет у себя аналитический метод для определения одного и того же лабораторного показателя и ей необходимо понять, в какой степени применим к новому методу референтный интервал, который она использовала для старого метода.

В последнем сценарии обслуживаемая лабораторией популяция неизменна, поэтому единственным критерием правильности переноса референтного интервала будет являться только сопоставимость двух аналитических методов: старого и нового. При внедрении нового метода обычной лабораторной практикой является проведение сравнительного исследования старого и нового методов, в котором одни и те же пробы пациентов исследуются обоими методами. И если такое исследование показывает, что их результаты полностью сопоставимы по всему диапазону измерений (хорошая корреляция при отсутствии смещения), то референтный интервал, по мнению авторов руководства [1], можно принять без всяких изменений. Как известно, насколько хороша корреляция определяют по значениям коэффициента детерминации r², который представляет собой коэффициент корреляции r, возведенный в квадрат. Напомним, что коэффициент корреляции r вычисляют по формуле:

где индекс i – индексом суммирования, он изменяется от 1 до числа используемых для сравнения проб (например, до 40, если старым и новым методом измеряется уровень аналита в 40 пробах); х_i и y_i – результаты измерений уровня аналита соответственно старым и новым методами в одной и той же i-той пробе; ẋ и ẏ – средние значения результатов измерений, полученных старым и новым методами.

Следует всегда иметь в виду, что до проведения вычислений значений r надо полученные результаты проверить на наличие среди них выбросов и удалить их, если они обнаружатся. Коэффициент детерминации r² может принимать значения от 0 до 1. Чем ближе вычисленное значение r² будет к единице, тем лучше корреляция полученных результатов. И наоборот, если вычисленное значение r² будет близко к нулю, то никакой функциональной связи между результатами, полученными старым и новым методами, нет. Чтобы определить функциональную зависимость между результатами старого и нового методов проводят так называемый регрессионный анализ. Наиболее распространённый вид регрессионного анализа – линейная регрессия, когда находят линейную функцию, которая, согласно определённым математическим критериям, наиболее соответствует полученным данным. На практике линия регрессии чаще всего ищется в виде линейной функции y = a*x+b. Значения коэффициентов a и b определяются с помощью метода наименьших квадратов. Метод наименьших квадратов – это математический метод для нахождения наилучшего приближения вычисляемых данных к фактическим данным путем минимизации суммы квадратов отклонений между наблюдаемыми и вычисляемыми значениями. Для расчета коэффициентов a и b можно использовать следуюшие формулы:

Авторы руководства [1] полагают, что для корректного переноса референтных пределов по уравнению простой линейной регрессии необходимо, чтобы вычисленное значение r² было больше или равно 0,95 (r² ≥ 0,95). В случае, если значение r² будет меньше или равно 0,70 (r² ≤ 0,70), то тогда перенос невозможен. При промежуточных значениях коэффициента детерминации r², т.е. когда 0,95 < r² < 0,70, в принципе, возможно проведение перерасчета границ нового референтного интервала по старым границам путём использования уравнения регрессии.

Теперь рассмотрим случай, когда сравнительное исследование показывает хорошую корреляцию, т.е. когда r² ≥ 0,95, но в то же время имеется пропорциональное отрицательное или положительное смещение между результатами двух методов. Тогда авторы руководства [1] рекомендуют использовать уравнение регрессии, полученное в ходе сравнительного исследования, чтобы «скорректировать» референтный интервал с учетом этого систематического смещения. В руководстве [1] приводится следующий конкретный пример того, как это следует делать, а именно:

а) допустим, что результаты х и у сравнительного исследования соответственно старого и нового методов в диапазоне концентраций аналита от 50 до 250 дают с коэффициентом детерминации r² = 0,99 следующую наиболее подходящую линию регрессии: y = 1,570*x−0,832, т.е. а=1,570, а*b=0,832;

б) допустим, что референтный интервал для старого метода составляет 50-150;

в) тогда, поскольку между двумя методами существует очень хорошая корреляция, но имеется пропорциональное смещение, «скорректированный» референтный интервал для нового метода можно рассчитать, используя подходящую линейную регрессию, следующим образом: Пниж = (1,57*50)−0,832 = 77,72 (что округляется до 78) – значение для его нижнего предела и, соответственно, Пверх = (1,57*150)−0,832 = 234,82 (что округляется до 235) – значение для его верхнего предела. Таким образом, референтный интервал, который следует принять для нового метода, будет составлять 78-235.

Как видно из вышеизложенного, достаточно просто переносить существующий референтный интервал, при условии, конечно, что исследуемая популяция остаётся прежней, что преаналитические процедуры не изменяются и сопоставимость двух методов тоже оказывается вполне приемлемой. Хотя лаборатория должна, конечно, дополнительно протестировать минимум 40 образцов пациентов, и они должны быть выбраны таким образом, чтобы был представлен полный диапазон концентраций в здоровом и в патологическом состоянии. При необходимости подробную информацию о процедурах проведения сравнительного исследования аналитических методов можно найти в отдельном руководстве CLSI, а именно в документе [13].

Очевидным преимуществом вышеописанного протокола осуществления переноса является то, что он не требует анализа биопроб только от референтных лиц. Однако он имеет несколько ограниченное использование, поскольку может применяться только в том случае, когда рассматриваемый референтный интервал использовался в том же лечебном учреждении. Кроме того, требуется достаточно высокая корреляция результатов измерений уровня аналита старым и новым методами. И должно отсутствовать смещение между ними, чтобы они разделяли между собой один и тот же референтный интервал. В случаях, когда есть некоторые сомнения относительно правильности переноса референтного интервала, в руководстве предполагается, что должна быть проведена еще и его верификация.

Теперь вкратце рассмотрим общие правила верификации ранее установленного референтного интервала, рекомендуемые руководством [1]. Такая верификация предназначена главным образом для подтверждения того, что ранее установленный референтный интервал подходит для популяции, обслуживаемой лабораторией, принимающей этот интервал для своего использования. Заметим, что при переносе ГРИ в условиях схожих аналитических систем (АС) от одной популяции к другой руководство [1] допускает для процедуры верификации использование двух подходов: а) верификацию в форме субъективной оценки и б) верификацию с использованием образцов от условно здоровых лиц, соответствующих критериям включения/исключения и представляющих популяцию, обслуживаемую лабораторией.

Итак, авторы руководства допускают, что приемлемость переноса может быть оценена даже субъективно. Для этого лаборатория должна тщательно сопоставить свои характеристики с параметрами лаборатории, в которой были ранее разработаны переносимые ГРИ, с целью убедиться в их схожести. Основные аспекты при проведении анализа с целью подтверждения возможности применения установленного ранее референтного интервала для своей популяции в условиях схожести АС следующие: географические и демографические параметры, преаналитические процедуры, аналитический метод, референтная популяция, статистические методы для расчета референтных пределов. При хорошем совпадении параметров в вышеперечисленных пунктах применение для своей популяции переносимых ГРИ руководством в принципе допускается.

Теперь рассмотрим схему, так сказать, объективной верификации переноса референтного интервала с использованием небольшой референтной выборки. Этот подход более универсальный. Его можно использовать практически для всех случаев верификации. В том числе для верификация приемлемости переносимого референтного интервала, когда лаборатория хочет использовать в своей практике референтный интервал, предоставленный производителем набора реагентов. Или закрытой АС в целом. Или другой лабораторией для аналогичной АС. Понятно, что, как и в случае первого подхода преаналитические процедуры, используемые в принимающей референтный интервал лаборатории, не должны существенно отличаться от аналогичных процедур, которые использовались при его установлении.

Верификация по второму способу отличается от первого тем, что включает определение РЗ по крайней мере для 20 референтных лиц, которые считаются репрезентативными для здорового населения принимающей лаборатории. Критерии исключения, используемые для выбора этих лиц, должны быть подобны тем, которые использовались при изначальном установлении референтного интервала. Соответственно, все преаналитические и аналитические процедуры, используемые для определения этих 20 РЗ, также должны соответствовать аналогичным процедурам, которые использовались при определении исходного референтного интервала.

Следует помнить, что результаты лабораторных исследований референтных лиц, как и всегда, сначала проверяются на наличие среди них выбросов. В руководстве [1] для такой проверки рекомендуется использовать либо ранее описанный достаточно простой метод Диксона/Рида, либо метод Тьюки. Подход Тьюки подробно описан в руководстве [1]. Он хотя и более сложный, но считается статистически более надежным, чем метод Диксона/Рида. При выявлении среди РЗ выбросов они должны быть устранены, и взамен дополнительно получены новые референтные значения. Так чтобы для проведения верификации в конечном итоге иметь в наличии статистически однородную группу из 20 РЗ.

В соответствии с рекомендациями, считается, что верификация имеет положительный результат, если не более 2 из 20, т.е. 10%, РЗ выходят за пределы переносимого референтного интервала. В таком случае лаборатория может принять в свою практику этот референтный интервал. Если же 3 или более РЗ выходят за пределы переносимого референтного интервала, то всю процедуру получения РЗ следует повторить заново и получить снова 20 РЗ, но от другого набора референтных лиц. Как и в первом случае, если не более 2 из 20 РЗ выйдут за пределы референтного интервала, то лаборатория может принять установленный референтный интервал в свою практику. Однако если снова 3 или более значений выйдут за пределы верифицируемого референтного интервала, то это будет являться признаком того, что обслуживаемая данной лабораторией популяция существенно отличается от той, которая использовалась для изначального определения референтного интервала. Поэтому его принятие для данной лаборатории вряд ли целесообразно. Правда, такое обстоятельство может быть также обусловлено и какими-либо неявными различиями в преаналитических и/или аналитических процедурах, и такую возможность тоже надо иметь ввиду. Ее также следует рассмотреть. И если она подтвердится, то внести должные исправления в соответствующие аналитические или преаналитические процедуры. Если и после этого проблема остается нерешенной, то тогда авторы руководства [1] предлагают лаборатории рассмотреть возможность самостоятельного установления референтного интервала.

В зависимости от способа получения РЗ, выделяют прямой и непрямой методы определения групповых референтных интервалов. В первом случае с целью получения таких значений лабораторией проводится целенаправленный рекрутинг референтных индивидуумов, тогда как при непрямом подходе источником РЗ служит массив данных, уже накопленный в медицинских или лабораторных информационных системах.

Руководство [1] рекомендует по возможности и, так сказать, при прочих равных условиях, использовать прямой метод определения референтных интервалов, в связи с чем именно он, хотя и вкратце, будет описан далее первым. В соответствии с этим документом, основные шаги при прямом методе определения референтных интервалов следующие:

1. Выявление на основе данных литературы возможных факторов биологической и аналитической вариации для исследуемого аналита.

2. Определение с учетом этой информации критериев включения/исключения обследуемых индивидуумов с последующим их включением в анкету участников проекта для выявления среди них тех, кто может быть включен в референтную группу. Типовой набор первичных критериев включения/исключения приведён для примера в руководстве [1].

3. Установление для исследуемого аналита требуемого количества референтных индивидуумов в зависимости от предполагаемого статистического метода расчета референтных пределов, в том числе для каждой из выделяемых подгрупп, если их предполагается выделять.

4. Подписание у каждого из предполагаемых участников согласия на участие в исследовании и сбор заполненных анкет.

5. Проверка отобранных потенциальных референтных индивидуумов по данным анкеты на предмет соответствия заранее определенным критериям включения/исключения и исключение из них тех, которые не подлежат включению в референтную группу согласно этим критериям.

6. Формирование подгруппы референтных индивидуумов на основе данных их анкет в случае предполагаемого их выделения.

7. Подготовка отобранных участников к взятию биоматериала в соответствии с процедурой, обычно используемой в лаборатории.

8. Забор и обработка биопроб референтных индивидуумов.

9. Проведение лабораторного исследования преобразованных должным образом биопроб для получения РЗ.

10. Построение частотной гистограммы РЗ и оценка вида их распределения.

11. Идентификация возможных ошибок и/или выпадающих значений (выбросов).

12. Проведение анализа РЗ: выбор статистического метода и вычисление референтных пределов и их доверительных интервалов.

13. Документирование всех шагов и процедур.

В руководстве [1] также отмечается, что поскольку преаналитические факторы, в основном перечисленные ниже в Таблице 12.1, могут оказывать существенное влияние на результаты лабораторных исследований, то сотрудникам лаборатории очень важно помнить, что помимо обеспечения качества на аналитическом этапе им необходимо также стандартизовать и строго контролировать все преаналитические процедуры. Причем как в ходе проведения исследований проб референтных индивидуумов, так и при проведении рутинных исследований.

Таблица 12.1. Преаналитические факторы, которые следует учитывать как влияющие на результат измерения уровня аналита из руководства [1]

Подготовка субъекта исследования	Забор проб	Обработка образцов
● Предшествующая диета ● Голодание или не голодание ● Воздержание от фармпрепаратов ● Режим приема лекарств ● Время забора по отношению к биологическим ритмам ● Физическая активность ● Период отдыха перед забором пробыСтресс	● Внешние условия забора ● Время забора проб ● Положение тела ● Тип образца ● Место взятия пробы ● Подготовка места ● Кровоток ● Оборудование ● Техника забора ● Время наложения жгута	● Транспортировка ● Наличие свертывания ● Разделение сыворотки/плазмы ● ХранениеПодготовка к анализу

Описанный выше алгоритм прямого метода относится к так называемому подходу «a priori», когда исключение по заданным критериям выполняется до взятия биоматериала. В случае «a posteriori» критерии исключения применяются после сбора образцов, и в такой ситуации придется рекрутировать заведомо большее число потенциальных референтных индивидуумов, чтобы в конечном итоге иметь достаточное их количество в референтной выборке с точки зрения статистики. Надо отметить, что критерии включения/исключения являются одним из самых дискуссионных моментов в исследованиях по определению референтных интервалов. Прежде всего, это связано с тем, что не существует единого понятия условно здорового человека. Также понятно, что с практической точки зрения очень жесткие ограничения приведут к низкой эффективности задачи рекрутинга требуемого количества референтных индивидуумов, а также существенно повысят стоимость предварительного обследования и отбора. При определении критериев включения/исключения важно помнить об основном предназначении референтного индивидуума, а именно – служить отражением исследуемой популяции. В любом случае, необходимо дать четкое описание отобранной референтной популяции для ясного понимания ограничений клинической применимости референтных интервалов, полученных в исследовании. Пример возможных критериев исключения, взятый из руководства [1], приведен в Таблице 12.2.

Таблица 12.2. Примерный перечень возможных критериев исключения

● Аномальное артериальное давление ● Беременность Вид деятельности, профессия ● Генетические факторы ● Госпитализация, текущая/недавняя ●Донорство ● Злоупотребление витаминами ● Курение ● Лактация

● Наркотическая зависимость ● Недавняя болезнь, операция ● Недавняя трансфузия ● Ожирение ● Окружающая среда ● Оральные контрацептивы ● Прием лекарств ● Состояния натощак или после приема пищи ● Употребление алкоголя

После получения запланированного количества РЗ обязательно проводится проверка на наличие среди них выбросов. Для этого используют либо ранее упомянутый метод Диксона/Рида, либо другие критерии выявления выбросов. Следует иметь в виду, что после удаления найденного выброса аналогичный критерий необходимо применять и к оставшимся референтным значениям. И делать это до тех пор, пока среди них не останется выбросов. И только после этого следует приступать к вычислению референтных пределов. Отметим, что руководство [1] допускает несколько методов для расчета таких пределов: параметрический, непараметрический и робастный.

Первый метод предполагает, что распределение полученных РЗ является нормальным. Если это и на самом деле так, то тогда референтные пределы рассчитываются по известной формуле: среднее арифметическое РЗ плюс/минус (+/–) 1,96*SD, где SD – их стандартное отклонение.

Если распределение полученных РЗ не является нормальным, но близко к логарифмически нормальному, как это достаточно часто бывает для многих аналитов, то тогда можно попробовать предпринять попытку преобразовать полученные референтные значения так, чтобы преобразованные значения стали бы иметь нормальное распределение. Для этого обычно используют логарифмическую функцию: Z = log_А(Y), где Y – это полученное референтное значение, Z – преобразованное референтное значение, соответственно, А – основание логарифма. Если это удается сделать, то тогда для вычисления референтных пределов на базе преобразованных значений можно использовать алгоритм параметрического метода, т.е. вычислять их как среднее преобразованных РЗ +/–1,96*SD_z, где SD_z – стандартное отклонение преобразованных РЗ Z. А затем провести обратное преобразование полученных таким образом значений референтных пределов с использованием показательной функции А в степени Z, которая как раз и является обратной функцией для логарифмической функции log_А(Y). Иначе говоря, если логарифмировали какое-либо значение Y по основанию логарифма А и получали, скажем, значение Z, что записывается как log_А(Y) = Z, то тогда, чтобы провести обратное преобразование и вернуться от Z к Y, надо А возвести в степень Z. Т.е. обратное преобразование будет выглядеть как Y = А^Z (A в степени Z). Тогда, если мы при логарифмировании полученных РЗ использовали функцию логарифма по основанию А и получили нижний и верхний логарифмический предел в виде значений Z1 и Z2 , то тогда, чтобы провести обратное преобразование и вернуться к обычным значениям среднего Yср и границ Y1 и Y2, надо А возвести соответственно в степень Zср, Z1 и Z2 , и тогда получим: Yср = А^Zср (А в степени Zср), Y1= А^Z1 (А в степени Z1) и, соответственно, Y2 = А^Z2 (А в степени Z2). Практика показывает, что такой подход удачно срабатывает для очень многих аналитов, для которых первоначально полученные референтные значения не имели нормального распределения, но имели распределение близкое к логарифмически нормальному.

Но, как показывает опыт, не для всех аналитов распределение РЗ бывает нормальным или близким к нему. В таких случаях для расчёта референтных переделов используют непараметрический метод, для которого вид распределения не имеет значения. По этой причине он и был рекомендован IFCC. Для вычисления референтных пределов непараметрическим методом полученные референтные значения ранжируют от меньшего к большему. И затем для выборки, например, объемом в 120 значений в качестве 2,5 перцентиля выбирают референтное значение, которое оказалось на третьей позиции, а в качестве 97,5 перцентиля выбирают значение, которое оказалось на 118-м месте. Они и будут являться нижним и верхним референтными пределами.

Как было упомянуто ранее, расчет референтного интервала можно также провести с использованием так называемых робустных методов. Робустный метод, как правило, включает итерационный процесс, в котором начальное местоположение (центр) оценивается по медиане, а начальный масштаб (разброс) – по медианному абсолютному отклонению относительно медианы. В этом итерационном процессе статистические веса фактических наблюдений снижаются в соответствии с их расстоянием от центральной тенденции выборки. В каждой итерации вычисляется некая величина Tbi, представляющая собой обновленную оценку центральной тенденции. Это делается до тех пор, пока изменение последовательных итерационных значений величины Tbi не станет незначительным. Процесс подробно проиллюстрирован в Приложении B руководства [1]. Хотя робустный метод можно использовать даже с небольшим количеством РЗ, но, как упоминается в этом документе, весьма вероятно, что доверительные интервалы для референтных пределов будут получаться слишком широкими. Поэтому авторы руководства [1] не решаются рекомендовать его широко, а только для самых крайних случаев.

В руководстве [1] особо отмечается, что референтные пределы должны представляться с 90% доверительным интервалом, описывающим диапазон возможных значений истинного референтного предела с 90% вероятностью. Чем такой доверительный интервал уже, тем надежнее будет и сам референтный интервал. Считается приемлемым, когда доверительный интервал не превышает 0,2 ширины референтного интервала. Наиболее сильно на размер доверительного интервала влияет объем выборки. Согласно рекомендациям [7] для расчета надежных референтных пределов непараметрическим методом потребуется как минимум 120 РЗ, а для определения референтных пределов параметрическим методом необходимо будет иметь более 200 РЗ. В тоже время при использовании робастного метода для вычисления надежных референтных пределов можно обойтись и 80 референтными значениями.

Краткое описание статистических подходов для анализа референтных интервалов представлено в работе [14], включая рекомендации по принятию решения об их разделении на подгруппы. Наиболее частыми критериями для разделения референтных интервалов на подгруппы являются, как известно, пол и возраст. Опыт исследований РЗ показывает, что при выяснении необходимости разделения их на разные подгруппы весьма целесообразно проводить отдельный статистический анализ этих значений не только для разных полов, но и для разных возрастных подгрупп. Особенно важно это делать для аналитов, концентрация которых зависит от индекса массы тела. Если проведённый анализ РЗ покажет необходимость определения отдельных референтных интервалов для тех или иных подгрупп, то в таком случае необходимо будет накопить соответствующие количества РЗ для каждой отдельной подгруппы с последующей их статистической обработкой по алгоритму, который предполагалось использовать для определения общего референтного интервала для данной популяции.

Следует отметить, что в последнее время возрастает интерес также и к непрямому методу определения референтных интервалов, который теперь часто называют «дата майнинг». Несмотря на такие его явные недостатки, как неполная информация о референтных индивидуумах, исключение нездоровых лиц только при использовании статистических приемов, недостаточность контроля преаналитического этапа и аналитических условий, члены комитета IFCC все же считают возможным использование непрямого метода, но только в ряде случаев. Это относится к ситуациям, когда сложно рекрутировать требуемое количество референтных индивидуумов для проведения исследования прямым методом, в частности при определении референтных интервалов для детей, пожилых лиц, беременных. При непрямом методе предпочтение отдается использованию данных пациентов, обследуемых амбулаторно. В случае использования госпитальных баз потребуется дополнительно идентификация заболеваний по кодировке с исключением определенных подгрупп в зависимости от исследуемого аналита. Также для исключения могут использоваться другие доступные в системе данные о состоянии здоровья пациента. С целью снижения вероятности наличия патологического результата используются только референтные значения пациентов с единственным результатом, либо в серии измерений выбирается последний результат. Конечно, у непрямого метода имеются и свои достаточно явные достоинства, к которым относятся отсутствие больших затрат на рекрутинг референтных индивидуумов, включая взятие и тестирование биоматериала, плюс использование РЗ, непосредственно относящихся к обслуживаемой популяции, а также получение РЗ в пре– и аналитических условиях, соответствующих реальной рутинной практике действующей лаборатории. Но референтные пределы при непрямом методе рассчитываются только с помощью специальных математических инструментов, которые менее чувствительны к присутствию патологических результатов по сравнению с классическими параметрическим или непараметрическим методами.

В качестве выводов к первой части данной лекции процитируем в несколько сокращенном виде раздел «Резюме» руководства [1], в котором перечислены важнейшие, по мнению его авторов, аспекты установления лабораториями ГРИ для своих нужд.

1) Авторы считают, что выбор референтных лиц должен быть продуманным, с предварительным рассмотрением критериев исключения и разделения. Чем лучше референтные лица определены и описаны, тем большей будет ценность установленных референтных интервалов. При этом авторы, с одной стороны, отклоняют концепцию «золотого стандарта» референтной популяции для определения связанного со здоровьем референтного интервала в виде абсолютно здоровых молодых людей, а с другой стороны, рекомендуют максимально минимизировать использование пациентов больниц или клиник в качестве референтных, отбирая из них референтных индивидуумов очень тщательно, опираясь на критерии исключения и разделения.

2) Авторы также считают, что все преаналитические и аналитические процедуры, связанные с измерением РЗ, должны быть тщательно проанализированы на предмет их одинаковости как для референтных лиц, так и для обследуемой популяции пациентов.

3) Авторы считают необходимым после сбора данных подготовить и визуально изучить частотную гистограмму РЗ с целью облегчить ее анализ, не забывая проверять их на наличие выбросов.

4) Авторы считают также, что для оценки референтных интервалов предпочтительно следует использовать непараметрический метод. И не столько из-за его простоты и надежности, сколько из-за того, что он не требует никаких конкретных предположений о математической форме распределения вероятностей РЗ. Плюс к этому для непараметрического метода требуется минимальный объем выборки из 120 РЗ (для каждой референтной популяции или подкласса).

5) Авторы руководства рекомендуют использовать строгий и систематический подход для определения необходимости выделения отдельных подклассов для референтных интервалов.

6) Авторы считают возможным, ввиду сложности получения отдельными лабораториями достаточного количества референтных лиц, организовывать так называемые мультицентровые испытания, которые позволяют объединять данные из нескольких мест. В таких случаях все участники исследований должны убедиться в сопоставимости своих аналитических методов и критериев отбора референтных лиц, а также в отсутствии причин, препятствующих объединению данных, которые могут быть обусловлены различиями в популяции, такими как раса и регион.

7) Авторы руководства обращают особое внимание лабораторий на необходимость получения достаточно большого количества РЗ для установления надежных доверительных границ референтных интервалов. Чем больше будет использовано РЗ для формирования референтного интервала, тем более узким и более полезным он будет. Независимо от используемого для вычислений метода. В случае применения непараметрического метода нужно иметь не менее 120 значений, чтобы получить надежные 90% доверительные интервалы для их пределов. При слишком малом количестве РЗ доверительные интервалы могут оказаться настолько широкими, что станут практически бессмысленными.

8) Авторы отмечают, что в тех случаях, когда лаборатория, внедряющая новый аналитический метод, хочет адаптировать референтный интервал, определенный ранее на собственной популяции, то тогда она может просто использовать процесс переноса, хотя и с некоторыми оговорками: авторы настоятельно рекомендуют лабораториям проверить новый референтный интервал на небольшой группе референтных индивидуумов.

9) Авторы руководства отмечают также, что установление референтных интервалов в полном соответствии с их рекомендациями может выходить за рамки возможностей большинства отдельных лабораторий. Тем не менее они считают, что проверка установленных где-то еще референтных интервалов, например, изготовителями наборов реагентов, осуществима практически для большинства отдельных лабораторий. Поскольку можно, имея всего лишь 20 образцов от референтных лиц, использовать относительно простой алгоритм для проверки приемлемости ранее установленного референтного интервала для своей собственной популяции.

10) Авторы полагают, что для некоторых аналитов, например, холестерина или гликированного гемоглобина, установление и проверка традиционных референтных интервалов по правилам руководства, нецелесообразны. Для таких аналитов, где существует национальный (или международный) консенсус по пределам принятия решений, вполне достаточно, чтобы производители и лаборатории гарантировали, что их методы обеспечивают точные результаты на образцах пациентов.

11) Авторы также отмечают, что рекомендации по установлению референтных интервалов, изложенные в руководстве [1], следует использовать как для лабораторий, так и для производителей.

И, наконец, авторы руководства полагают, что изложенные ими рекомендации являются необходимым и достаточным основанием для установления лабораториями надежных референтных интервалов, адекватных обслуживаемым ими популяциям. Основные принципы, изложенные выше, по мнению авторов руководства [1], одинаково важны и должны лежать в основе любого исследования РЗ.

Следует отметить, что в периодической печати уже появляются статьи и отечественных авторов [23, 24], посвященные определению ГРИ с использованием прямых и косвенных методов, включая применение моделей на базе ГСТ. Но, к сожалению, в этих публикациях не приводятся оценки точности определения границ ГРИ.

Переходим теперь ко второй части данной лекции, а именно к рассмотрению вопросов установления персонифицированных референтных интервалов. Излагаемые далее рекомендации опираются главным образом на материалы не так давно опубликованных исследований, результаты которых изложены в работе [3], а также в более ранней работе практически того же авторского коллектива [15]. Отметим, что работа [3] была уже опубликована на русском языке [4].

Формулируя цель своих изысканий, авторы этой работы отмечают, что они исходили из некоторых очень важных диагностических и, можно даже сказать, метрологических постулатов. Прежде всего, из того, что использование лабораторных результатов как для диагностики нозологий, так и для мониторинга эффективности применяемых средств для лечения пациента, требует наличия надежного метрологического репера, с которым их можно было бы сравнивать. В качестве такого репера сейчас общепринято использовать либо верхний, либо нижний пределы групповых референтных интервалов. Между тем уже достаточно давно известно, что существует множество ограничений на применение для индивидуумов групповых референтных интервалов [16]. Для того, чтобы обходить такие ограничения, авторы работы [3] предложили использовать наряду с групповыми еще и персонифицированные референтные интервалы, для определения которых они разработали достаточно простую технологию и испытали ее на практике. Сама по себе эта идея не новая: первоначально идея начать использовать в клинической практике персонифицированные референтные интервалы возникла еще в 1960-х годах [6]. В этой, в некотором смысле, основополагающей работе еще тогда указывалось, что «было бы очень полезно установить диапазон биологической вариации уровней аналитов непосредственно для каждого здорового человека». Позднее, в 1970-х годах, в работе [17] был впервые предложен алгоритм определения таких внутрииндивидуальных биологических вариаций, но он оказался достаточно сложным и неудобным для практического применения. И только совсем недавно именно авторы работ [3, 15] предложили действительно достаточно простую модель определения внутрииндивидуальных биологических вариаций содержания аналитов непосредственно для конкретных индивидуумов. Такая технология позволила сравнивать текущие результаты лабораторного исследования пробы пациента с его персонифицированным референтным интервалом, который, в свою очередь, устанавливается на основе предыдущих лабораторных результатов, полученных в стабильном состоянии этого индивидуума, то есть в условиях, когда его можно было считать практически здоровым.

Алгоритм такого определения персонифицированных или, проще говоря, индивидуальных референтных интервалов (поэтому далее будет использована аббревиатура ИРИ) основывается на гомеостатической модели внутрииндивидуальной биологической вариации уровней аналитов. Как уже упоминалось ранее в данной лекции, в такой модели предполагается, что в стабильных условиях у индивидуума, в том числе и у пациента, концентрация каждого аналита колеблется вокруг гомеостатической точки (ГСТ). Такая вариация уровня аналита у здорового индивидуума, по мнению авторов, является по сути внутренне ему присущей биологической вариацией. На первом этапе, прежде чем переходить непосредственно к определению пределов ИРИ, авторы работы [3] сначала оценивают суммарную вариацию TVset уровня аналита вокруг ГСТ, включая в нее и биологическую и аналитическую составляющие, для чего используют следующую формулу:

где SD_b – это внутрииндивидуальная биологическая вариация уровня аналита, представляющая собой либо усредненное по референтным индивидуумам значение внутри индивидуальной биологической вариации CV_i из базы данных EFLM в виде стандартного отклонения SD_i (первый вариант расчета, предлагаемый авторами), либо персонифицированное значение внутрибиологической вариации уровня аналита CVp, полученное для конкретного индивидуума, в виде стандартного отклонения SD_p (второй вариант расчета, предлагаемый авторами); SD_a – оценка аналитической вариации СV_a в виде стандартного отклонения; n – количество результатов измерений, используемых для оценки уровня аналита Агст, соответствующего ГСТ конкретного индивидуума; k – некая константа, зависящая от вероятности и типа распределения, используемого для определения пределов ИРИ. Каким образом ее значения определяется авторами работы [3] станет ясно дальше. В этом уравнении фактор [(n+1)/n] представляет собой, как поясняют авторы этой же работы [3], некую неопределенность, которая в основном обуславливается определением уровня аналита в ГСТ.

После определения значения TVset верхний Пверх и нижний Пнижн пределы ИРИ для конкретного индивидуума авторы работы [3] предлагают рассчитывать с помощью уравнений (12.8) и (12.9):

Если теперь подставить показатель TVset из уравнения (12.7) в уравнения (12.8) и (12.9), то получатся уравнения (12.10) и (12.11):

Хотя эти уравнения и позволяют, в принципе, рассчитывать пределы ИРИ, но они имеют два критических параметра Агст и TVset, которые, так или иначе, должны быть оценены практически. Вполне понятно, что для расчета пределов ИРИ по уравнениям (12.10) и (12.11), так или иначе, дополнительно потребуются оценочные значения внутрииндивидуальной биологической вариации (либо по первому, либо по второму варианту расчета, предлагаемых авторами работы [3]), плюс еще оценочное значение аналитической вариации, а также оценочное значение уровня аналита в ГСТ.

С целью получения таких оценок для конкретных пациентов авторы работы [3] предлагают использовать их предыдущие лабораторные результаты. Вполне понятно, что использовать такие данные для расчета показателя Агст для конкретного пациента можно будет только если лабораторные результаты получены, когда он был практически здоров, находясь в устойчивом состоянии. Результаты, выходящие за пределы ГРИ или уровней принятия клинических решений, как полагают авторы работы [3], в принципе не должны использоваться. Вполне понятно, что при наличии у лаборатории соответствующих возможностей, такие результаты могут быть получены ею или путем проведения специальных исследований непосредственно для этой цели или в рамках проведения рутинных исследований.

Процесс подготовки к определению пределов ИРИ авторы работы [3] предлагают проводить в два этапа. Сначала считают необходимым оценить качество предыдущих результатов измерений уровня аналита, по которым будет следом вычисляться значение Агст и пределы ИРИ для конкретного индивидуума. А только затем уже, на втором этапе, авторы предлагают проводить оценку значений TVset при двух различных вариантах выбора внутрибиологической вариации SD_b, как об этом уже упоминалось ранее.

Итак, на первом этапе, поскольку экстремальные результаты могут значительно изменить значение Агст, результаты измерений, отобранные для проведения вычислений ИРИ, прежде всего анализируются на наличие среди них выбросов. Если таковые будут обнаружены, то их следует исключить из дальнейших расчетов. Для обнаружения выбросов авторы считают возможным использовать любые статистические тесты, но сами рекомендуют использовать или упомянутый ранее тест Диксона/Рида или тест Граббcа. Затем, после исключения выбросов, оставшиеся результаты, как считают авторы, следует также проанализировать на наличие положительной или отрицательной тенденции.

Выявлять наличие и оценивать значимость таких тенденций авторы работы [3] предлагают с помощью линейного регрессионного анализа, используя следующий критерий: если 95% доверительный интервал наклона линии регрессии, то есть диапазон, в котором с 95% вероятностью находится истинный коэффициент такого наклона, включает 0, то тогда можно считать, что тенденция является статистически незначимой и что индивидуум находится в устойчивом состоянии. В противном случае, если 95% доверительный интервал наклона линии регрессии не включает 0, тенденция должна рассматриваться как статистически значимая, и такие результаты не следует использовать для вычисления значений Агст и пределов ИРИ.

Формулы для вычисления границ 95% доверительного интервала наклона линии регрессии выглядят следующим образом: βниж = β₀–t_(α/2,n–2)*SE_β и βверх = β₀+t_(α/2,n–2)*SE_β, где βниж и βверх – соответственно нижняя и верхняя границы доверительного интервала, β₀ – оценка наклона линии регрессии, t_(α/2,n–2) – критическое значение из t-распределения Стьюдента для уровня значимости α и степени свободы n–2, SE_β – стандартная ошибка оценки наклона, вычисляемая по формуле SE_β = √[Σ(X_i–Хср)²/(n–2)]/√[Σ(Ti–Tср)²], где n – количество результатов измерений, X_i – результат измерения уровня аналита в i-той пробе пациента, Xсp – среднее значение результатов измерений уровня аналита в пробах пациента, Т_i – время суток, когда производился забор пробы у пациента для получения i-того результата измерения уровня аналита, Тсp – среднее значение времени суток, когда производились заборы проб у пациента. Сам же расчет уровня аналита, соответствующего гомеостатической равновесной точке того или иного пациента, авторы предлагают проводить по формуле (12.12), фактически вычисляя среднее значение результатов измерений уровня этого аналита при проведении предыдущих его анализов:

где Xср – среднее значение предыдущих результатов измерений уровня аналита в пробах пациента в его стабильном состоянии; Х₁, Х₂…+Х_n–1,Х_n – результаты измерения уровня исследуемого аналита X_i; n – количество результатов измерений, включенных в расчет. Стандартная ошибка SD_гст среднего значения Xср, то есть по сути значения Агст, рассчитывается с использованием уравнения (12.13):

где V – дисперсия распределения результатов измерения уровня исследуемого аналита, которая описывается либо показателем σ², либо показателем SDn² соответственно в случае популяции (статистически достаточно большого количества результатов, т.е. 200 и более) или в случае представительной их выборки, т.е. где-то около 20). Из уравнения (12.13) видно, что увеличение n, уменьшает неопределенность значения Агст обратно пропорционально квадратному корню из n. Однако, как отмечают авторы работы [3], если количество n предыдущих результатов измерений будет невелико, то тогда вместо среднего значения, можно использовать медианное значение в качестве меры Агст. В этом случае для вычисления пределов ИРИ следует использовать непараметрический метод расчета.

Теперь переходим ко второму этапу. Сначала рассмотрим первый вариант расчета пределов ИРИ, предлагаемый авторами работы [3], который основывается на использовании усредненного по референтной популяции значения внутрииндивидуальной биологической вариации, обычно обозначаемого как CV_i. Как ранее уже упоминалось, показатель CV_i представляет собой «среднюю» флуктуацию уровня измеряемой величины вокруг некого усредненного по референтной популяции значения (Агст)ср, т.е. полученного, в свою очередь, «усреднением» индивидуальных показателей Агст по группе референтных лиц. Верхним и нижним пределами такого ИРИ будут являться соответственно верхний и нижний пределы показателя TVset, которые могут быть рассчитаны с использованием уравнений (12.10) и (12.11). Если для представления биологической компоненты в этих уравнениях будет использована оценка SD_i (или оценка CV_i), то тогда формулы (12.10) и (12.11), как считают авторы работы [3], будут выглядеть следующим как образом:

где Пверх_i и Пнижн_i – оценка соответственно верхнего и нижнего предела ИРИ на базе «усредненного» по популяции показателя внутрииндивидуальной биологической вариации CV_i; SD_i – «усредненное» по популяции стандартное отклонение внутрииндивидуальной биологической вариации; z – табличное значение показателя z-score, которое, в случае нормального распределения результатов измерений, может быть принято равным 1,96 для 95% двустороннего доверительного интервала. Оценка SD_a представляет здесь соответствующую долгосрочную оценку аналитической вариации аналитической системы, с помощью которой были получены результаты измерений для установления ИРИ. Именно поскольку при оценке SD_i предполагается, что распределение результатов измерений является нормальным, авторы руководства [3] считают возможным использовать соответствующую z-оценку в этих уравнениях. В зависимости от того, какие предпочтения имеются по использованию ИРИ, z-значения выбираются либо как для двустороннего доверительного интервала, либо как для одностороннего доверительного интервала.

Следует отметить, что, несмотря на упоминание термина «внутрииндивидуальная» биологическая вариация, на самом деле представляющий ее здесь показатель SD_i выводится, как известно, из данных исследуемой референтной популяции. Поскольку значение для показателя Агст определяется на базе данных индивидуума, а значение для показателя SD_i на базе данных популяции, то значения пределов для интервала ИРИ, как считают авторы [3], можно рассчитать с использованием модели интервала прогнозирования, основанной на неизвестном среднем значении и известной дисперсии. Для большого числа аналитов, исследуемых в лабораториях, общепризнанные значения CV_i представлены в базе данных биологических вариаций EFLM [9]. Но поскольку для расчета пределов ИРИ используются абсолютные (а не относительные) значения показателей биологической вариации, то, соответственно, помимо абсолютных значений для Агст должны быть вычислены абсолютные значения и для оценок биологической вариации в виде SD_i, опираясь на относительные значения для CV_i.

Теперь рассмотрим второй вариант расчета пределов ИРИ, предлагаемый авторами работы [3], который основывается на данных о персонифицированной биологической вариации конкретного индивидуума. Авторы отмечают, что поскольку значение SD_i представляет собой «усредненное» значение внутрииндивидуальной биологической вариации уровня аналита по представителям обследуемой популяции, то оно не вполне является специфичным для каждого конкретного индивидуума. Поэтому, в принципе, использование для оценки биологической вариации уровня аналита для конкретного индивидуума персонифицированного показателя SD_p вместо «усредненного» показателя SD_i было бы существенно предпочтительнее для вычисления пределов ИРИ. По сравнению с показателем SD_i показатель SD_p является новой концепцией и действительно отражает персонифицированную биологическую вариацию уровня аналита у конкретного индивидуума. Понятно, что для установления значения SD_p для каждого конкретного индивидуума обслуживаемой популяции лаборатории потребуются значительные ресурсы, в т.ч. статистически значимые количества дополнительных результатов измерений, что будет притормаживать внедрение именно таких персонифицированных ИРИ. И, тем не менее, перспективы такого подхода очевидны вследствие своих явных преимуществ для диагностирования нозологий.

Авторы работы [3] полагают, что поскольку при таком подходе значения для показателей Агст и SD_p вычисляются на основе собственных данных индивидуума, то, таким образом, пределы ИРИ следует определять на базе модели интервала прогнозирования, основанной на неизвестном среднем значении и неизвестной дисперсии. В этой связи, авторы считают, что разумно будет предположить, что все результаты измерений, используемые для расчета как Агст, так и дисперсии (SD_p)², будут скорее иметь отношение к t-распределению, а не к нормальному распределению. Тогда, используя далее такой же алгоритм расчета показателя TVset, как и в первом подходе, верхний и нижний пределы ИРИ можно будет вычислять, подставляя вместо показателя SD_i показатель SD_p, по приведенным ниже формулам:

где Пверх_р и Пнижн_р – оценка соответственно верхнего и нижнего предела ИРИ на базе персонифицированного показателя внутрииндивидуальной биологической вариации; SD_p – персонифицированная внутрииндивидуальная биологическая вариация уровня аналита у конкретного индивидуума в виде стандартного отклонения; SD_а – аналитическая вариация в виде стандартного отклонения; T_(1–a/2) – табличное значение для параметра t со степенью свободы n–1. Следует выбирать соответствующие значения для показателя T в зависимости от того, какой доверительный интервал для ИРИ будет использоваться: двухсторонний или односторонний. В первом случае следует использовать табличное значение T_(1–a/2), а во втором значение T_(1–a). Для расчетов пределов ИРИ оценочные значения SD_p и SD_а должны быть получены на основе анализа данных из одной и той же лаборатории. При таком подходе SD_p и SD_а будут являться компонентами общей вариации SD_TV результатов измерений, используемых для расчета пределов ИРИ. В этой связи, не рационально разделять SD_а и SD_p, поскольку именно эти оба показателя и определяют соответствующим образом стандартное отклонение общей вариации SD_TV, а именно следующим образом:

Тогда после подстановки показателя SD_TV из уравнения (12.18) в уравнения (12.16) и (12.17) получаются следующие формулы для вычисления пределов ИРИ по второму варианту их расчета, предлагаемого авторами работы [3], когда доверительный интервал для ИРИ будет использоваться двухсторонний:

Авторы работы [3] отмечают, что уравнения (12.19) и (12.20) дают оценки ИРИ как интервала прогнозирования в общем-то для одиночного наблюдения. Но, тем не менее, поскольку в клинической практике обычно сравнивают результат отдельного измерения с референтным интервалом, то тогда именно уравнения (12.19) и (12.20) следует использовать для клинической интерпретации лабораторных результатов пациента.

Авторы работы [3] также отмечают, что при расчете пределов ИРИ важно учитывать количество накопленных результатов предыдущих тестов, полученных в устойчивом состоянии здоровья индивидуума. Строгого ограничения на минимальное количество данных для расчета пределов ИРИ в общем-то нет. Однако увеличение количества результатов измерений приводит к уменьшению показателя TVset и тем самым позволяет лучше оценивать показатель Агст, как это указывается в работе [15]. Необходимое количество результатов измерений также варьируется в зависимости от биологического компонента TVset. Если использовать для расчета пределов ИРИ показатель SD_i, то даже трёх результатов измерений может быть достаточно для расчета показателя Агст, как это было показано работе [15]. Однако анализ тренда не может быть надежно выполнен только на основе этих трёх результатов, и поэтому TVset будет на 15% шире его фактического уровня. Поэтому авторы работы [3] предлагают включать, по крайней мере, пять результатов измерений для модели на основе SD_i. Хотя, в принципе, модель, основанная на оценках SD_p, может быть предпочтительнее, но для получения надежного ИРИ потребуется большее количество измерений, поскольку SD_p выводится с использованием собственных данных индивидуума. Если количество результатов будет превышать 30, то можно применять статистику, основанную на нормальном распределении. Хотя и понятно, что, скорее всего, вряд ли будет возможно это реализовывать в обычной ситуации для большого числа пациентов.

Примечание 12.1. Персонифицированные референтные интервалы и значения критической разности. Из-за достаточно высокой неопределенности результатов единичных исследований клиницисты часто запрашивают повторные тесты, стараясь таким образом уменьшить их диагностическую неопределенность. В этой связи были предложены различные подходы для интерпретации результатов многократных исследований [18, 19]. В т.ч. авторы работы [19] ввели концепцию параллельного и последовательного тестирования для более чем одного исследуемого аналита. Они предложили при параллельном тестировании все биопробы анализировать дважды, тогда как при последовательном тестировании дважды анализировать только пробы с положительными результатами. Это они объяснили тем, что при использовании повторных измерений значимость разницы между последовательными результатами теста становится решающей для объективного принятия решений. В таких случаях эту разницу между последовательными результатами разумно сравнивать со значением критической разницы (показателем RCV), которое является разницей между результатами измерений уровня аналита в двух последовательно взятых пробах, которую в свою очередь еще можно объяснить преаналитической, аналитической и биологической вариациями уровня исследуемого аналита. Предполагая, что преаналитическая вариация незначительна, показатель RCV, как известно, можно рассчитывать, используя следующую формулу:

где RCV – значение критической разницы; SD_b – оценка внутрииндивидуальной биологической вариации уровня аналита, представляющая собой либо «среднее» по популяции значение внутри индивидуальной биологической вариации CV_i уровня аналита в виде стандартного отклонения SD_i (первый вариант расчета), либо персонифицированную индивидуальную биологическую вариацию уровня аналита CV_p у конкретного индивида в виде стандартного отклонения SD_p (второй вариант расчета); SD_a – оценка аналитической вариации СV_a в виде стандартного отклонения; z – константа, зависящая от уровня доверительной вероятности, и равная 1,96 для 95% двустороннего доверительного интервала. Авторы работы [3] отмечают, что показатели ИРИ и RСV дополняют друг друга в интерпретации результатов тестов пациентов. При этом, если показатель ИРИ, вернее его пределы, используется для диагностики, то показатель RCV используется для оценки разницы между последовательными измерениями и, следовательно, в основном используется при мониторинге. Следует иметь ввиду, что формулу (12.21) для вычисления значений показателя RCV можно получить из формулы (12.7) для расчета значений показателя TVset. Для этого надо в первую формулу подставить n=1, и тогда получим, что TVset = RCV. Тем не менее, не рекомендуется использовать только один результат измерения для расчета TVset, поскольку в этом случае неопределенность будет на 41% выше фактического уровня, как это показано в работе [15].

---

Примечание 12.2. Внедрение персонифицированных референтных интервалов в отчет о лабораторных исследованиях. По мнению авторов работы [3], показатель ИРИ определенно позволит улучшить интерпретацию результатов лабораторных тестов. Тем не менее, и с точки зрения авторов тоже, необходимы дальнейшие исследования, чтобы фактически убедиться в том, что такое использование действительно приведет к значимому улучшению клинических результатов. Авторы полагают, что перед внедрением в клиническую практику процедур, связанных с анализом данных и расчетом ИРИ, они должны быть прописаны именно так, как это было предложено самими авторами, предпочтительно в лабораторной информационной системе, чтобы ИРИ можно было автоматически включать в лабораторные отчеты для каждого конкретного пациента. С одной стороны, подход с использованием показателя SD_p будет, по всей видимости, обеспечивать более точную оценку ИРИ для каждого индивидуума, но, с другой стороны, для получения оценочного значения SD_p потребуется получить и существенно больше результатов измерений. Таким образом, на данный момент внедрение ИРИ, вычисляемого на основе показателя SD_i, может оказаться более оптимальным решением, особенно, если при вычислении референтных пределов ограничиваться небольшим числом результатов измерений, скажем, равным четырем или пяти. Авторы работы [3] рекомендуют, чтобы и ГРИ, и ИРИ в конечном счете были включены в лабораторные отчеты для всех аналитов, исследуемых в лаборатории. Это можно делать постепенно, начиная, например, с самых рутинных аналитов, в ней исследуемых. Видимо, важно также, чтобы сотрудники лаборатории заранее подготовили – совместно со своими ведущими клиницистами – рекомендации по использованию комбинации ГРИ и ИРИ при постановке диагноза и последующем наблюдении за пациентами. Хорошей базой для написания таких рекомендаций может послужить работа [20] тех же авторов, в которой они проводят сравнение ГРИ и ИРИ между собой для 48 широко исследуемых биохимических и гематологических аналитов. Весьма полезной при подготовке рекомендаций по совместному использованию ГРИ и ИРИ могут оказаться также работы [21] и [22], в которых их авторы фактически обосновывают необходимость смены парадигмы в интерпретации лабораторных результатов, предлагая использовать вместо ГРИ комбинированные референтные интервалы и комбинированные значения референтной критической разницы, определяемые на основе групповых и персональных данных здоровых или практически здоровых индивидуумов.

Пример 12.1. Вычисление ИРИ для сывороточного креатинина, из работ [3] и [15].

А) Начальная информация

Предполагается, что ранее для пациента А и пациента Б ранее в процессе рутинных исследований были получены соответственно 5 и 10 результатов измерений уровня сывороточного креатинина, значения которых представлены ниже в таблице 12.3.

Таблица 12.3. Результаты измерений концентрации сывороточного креатинина X_i (в мкмоль/л) в пробах пациента А и пациента Б (данные были несколько скорректированы и поэтому отличаются от тех, которые были использованы авторами работы [3])

Б) Последовательность расчета ИРИ для сывороточного креатинина у пациента A

Шаг 1. Оценка аналитического качества полученных данных

Результаты измерений, полученные для пациента А, были проанализированы на предмет возможных выбросов и наличия тенденции. Тест Диксона показал, что выбросов нет, т.к. оба значения показателя D (для наименьшего и наибольшего результатов измерений) оказались равными соответственно 3,20 и 0,90, что меньше критического значения Dкрит, вычисляемого по формуле Dкрит = R/3 и равного 3,23 для данных пациента А. Не было обнаружено и никаких значимых тенденций, т.к. коэффициент наклона линии регрессии β₀ оказался равным –0,05 (минус 0,05), а нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала наклона оказались равными соответственно –5,03 и 2,93 (минус 5,03 и плюс 2,93). Т.е. интервал, в котором с 95% вероятностью находится истинный коэффициент наклона, включает 0.

Шаг 2. Расчет уровня аналита Агст в гомеостатической точке и пределов ИРИ (персонифицированного референтного интервала) для пациента А. Уровень сывороточного креатинина Агст, соответствующий ГСТ, рассчитывался путем вычисления среднего значения предыдущих результатов измерений по формуле для вычисления среднего: Агст = (58,3+54,5+60,1+61,0+51,3)/5 = 57,04 мкмоль/л. Для расчета общей вариации уровня аналита вокруг ГСТ доступно только пять измерений. Табличное значение параметра t распределения Стьюдента со степенью свободы n–1 для 5 составляет 2,78. Поэтому выбирается модель, основанная на оценках внутрииндивидуальной биологической вариации CV_i. Из базы данных биологических вариаций EFLM [9] следует, что значение CV_i для креатинина равно 4,5%, которое и использовалось для определения значения SD_i. С учетом того, что Агст = 57,04 мкмоль/л, получаем показатель SD_i = 0,045*57,04 мкмоль/л = 2,57 мкмоль/л. Поскольку из данных лабораторного ВКК «было» известно, что CV_а = 2,21%, то соответственно получим, что SD_а = 0,0221*57,04 мкмоль/л = 1,27 мкмоль/л. Тогда пределы персонифицированного референтного интервала ИРИ для креатинина у пациента A можно рассчитать, используя формулы (12.14) и (12.15), как указано ниже:

(Пверх)_i = Агст+z*√[(n+1)/n]*(SD_i²+SD_a²) = 57,04+1,96*√[(6/5)*(2,57²+1,27²)] = 63,2 мкмоль/л

(Пнижн)_i = Агcт–z*√[(n+1)/n]*(SD_i²+SD_a²) = 57,04–1,96*√[(6/5)*(2,59²+1,27²)] = 50,9 мкмоль/л

Таким образом, для пациента А нижняя граница персонифицированного референтного интервала для сывороточного креатинина будет равна 50,9 мкмоль/л, а верхняя соответственно 63,2 мкмоль/л.

В) Последовательность расчета ИРИ для сывороточного креатинина у пациента Б

Шаг 1. Оценка аналитического качества полученных данных

Результаты измерений уровня аналита в пробах пациента Б были также сначала проанализированы на предмет наличия среди них возможных выбросов и тенденций. Тест Диксона показал, что никаких выбросов нет, т.к. оба значения показателя D (для наименьшего и наибольшего результатов измерений) оказались равными соответственно 2,70 и 1,90, что меньше критического значения Dкрит, вычисляемого по формуле Dкрит = R/3 и равного 3,00 для данных пациента Б. Не было обнаружено значимых тенденций, т.к. коэффициент наклона линии регрессии β₀ оказался равным 0,044 (плюс 0,044), а нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала наклона оказались равными соответственно –0,758 и 2,93 (минус 0,758 и плюс 0,846). Т.е. интервал, в котором с 95% вероятностью находится истинный коэффициент наклона, включает 0.

Шаг 2. Расчет уровня аналита Агст в гомеостатической точке и пределов ИРИ (персонифицированного референтного интервала) для пациента Б. Уровень сывороточного креатинина Агст, соответствующий ГСТ, рассчитывался путем вычисления среднего значения предыдущих результатов измерений по формуле для вычисления среднего: Агст = (80,4+76,9+85,9+83,1+79,6+84,0+84,0+81,3+84,0+76,9)/10 = 81,6 мкмоль/л.

Число предыдущих результатов измерений (n=10) приемлемо для расчета общей вариации. Табличное значение параметра t для распределения Стьюдента со степенью свободы n–1 для n=10 составляет 2,26. Поэтому авторы работы [3] использовали модель, основанную на персонифицированной биологической вариации, т.е. на показателе CV_p. Когда все биопробы были проанализированы в одной и той же лаборатории, нет необходимости разделять и затем объединять биологические и аналитические вариации. Поэтому общая вариация (включая аналитическую и внутрииндивидуальную компоненту) может быть описана как стандартное отклонение предыдущих результатов измерений, т.е. в виде показателя SD_TV, определяемого формулой (12.18) SD_TV = √[(SD_p)²+(SD_а)²]. Расчет значения SD_TV авторы проводили на основании 10 результатов измерений по известной формуле для стандартного отклонения SD_TV = √[Σ(Х_i–Xср)²/(n–1)] = 2,97 мкмоль/л. Таким образом, пределы ИРИ для креатинина у пациента Б можно рассчитать, используя формулы (12.19) и (12.20), как указано ниже:

(Пверх)_р = Агст+T_(1–α)/2*SD_TV*√[(n+1)/n] = 81,6+2,26*2,97х√11/10 = 88,6 мкмоль/л

(Пнижн)_p = Агст–T_(1–α)/2*SD_TV*√[(n+1)/n] = 81,6+2,26*2,97х√11/10 = 74,6 мкмоль/л

Таким образом, у пациента Б нижняя граница персонифицированного референтного интервала для сывороточного креатинина будет равна 74,6 мкмоль/л, а верхняя – 88,6 мкмоль/л соответственно.

Общие выводы к Лекции 12.

12.1. При оценке лабораторных результатов пациентов клиницисты в большинстве случаев опираются на ГРИ – групповые (популяционные) референтные интервалы. Надежность такой клинической интерпретации результатов обусловливается не только качеством измерительных характеристик используемых АС, но в не меньшей мере и адекватностью референтных интервалов контингенту, обследуемому лабораторией.

12.2. Решение всех задач по установлению ГРИ для контингента, обследуемого той или иной лабораторией, возлагается непосредственно на саму лабораторию, поскольку именно на нее возлагается обязанность за предоставление клиницистам правильных референтных интервалов, в т.ч. должным образом проверенных на соответствие обслуживаемым ими популяциям.

12.3. Обычно лаборатории используют в своей практике значения для референтных пределов, взятые либо из справочников, либо из инструкций изготовителей наборов реагентов. Но накопленный опыт показал, что такой выбор референтных интервалов может приводить зачастую к ошибочной интерпретации получаемых результатов.

12.4. Установление лабораториями адекватных ГРИ для всех своих аналитов является весьма сложной задачей. Понимая, насколько непросто будет для большинства лабораторий самостоятельно определить такие референтные интервалы, авторы руководства [1] предложили весьма целесообразное решение такой проблемы: устанавливать в лаборатории собственные ГРИ путем переноса по определенной и достаточно простой процедуре референтных интервалов, уже установленных ранее самой лабораторией или кем-то еще, с последующей их перепроверкой на правильность и адекватность такого переноса.

12.5. Из достаточно большого количества исследований по групповым референтным интервалам, проведенным в последние два десятилетия и опубликованным в периодических изданиях в области лабораторной медицины, вытекает, что существует множество ограничений для обобщения таких референтных интервалов на конкретных индивидуумов. В этой связи, за последние десять лет появились работы по установлению и практическому использованию индивидуальных (персонифицированных) референтных интервалов (ИРИ).

12.6. Работы в сфере установления ИРИ показали, что наличие в руках клиницистов персонализированных референтных интервалов ИРИ может предоставить средство для улучшения качества интерпретации лабораторных результатов конкретных пациентов. Пределы для таких ИРИ, как следует из предложенных моделей, можно достаточно просто рассчитывать, используя оценки биологической и аналитической вариаций, а также предыдущие результаты тестов, полученные для конкретных пациентов в их стационарной ситуации.

12.7. Необходимы будут, по всей видимости, дополнительные исследования, чтобы продемонстрировать, приводит ли использование ИРИ к существенно лучшим клиническим результатам. В любом случае, уже сейчас имеет смысл включать в лабораторные отчеты и ГРИ, и ИРИ, что скорее всего поможет улучшить качество интерпретации лабораторных результатов, по крайней мере, для отдельных пациентов. Это, в свою очередь, даст возможность постепенно накапливать клинический опыт их совместного использования.

---

Литература к Лекции 12.

1. IFCC, CLSI, EP28-A3c document, Defining, Establishing and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory: Approved Guideline, 3rd ed., vol.28, №30, 2010.

2. ГОСТ Р ИСО 15189-2024. «Медицинские лаборатории. Требования к качеству и компетентности» (утв. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии РФ от 22.11.2024 №1741-ст).

3. Coşkun A, Sandberg S, Unsal I, Yavuz F, Cavusoglu C, Serteser M, Kilercik M, Aarsand A. Personalized reference intervals – statistical approaches and considerations. CCLM. 2021;60(4):629-635. PMID: 34894385. DOI:10.1515/cclm-2021-1066.

4. Коскун А., Сандберг С., Унсал И. и др. Персонифицированные референтные интервалы – статис-тические подходы и соображения. Лабораторная служба. 2022; 11(4):46‑53. DOI:10.17116/labs2 0221104146.

5. ГОСТ Р 53022.3–2008 «Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов» (утв. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии РФ от 18.12.2008 №557-ст).

6. Grasbeck R, Saris N-E. Establishment and use of normal values. Scand J Clin Lab Invest, 1969, Vol.26 (Suppl.110), 62-63.

7. Siest G, Henny J, Grasbeck R, Wilding P, Petitclerc C, Queralto J, Petersen P. The theory of reference values: an unfinished symphony. CCLM.2013;51(1):47-64. DOI:10.1515/cclm-2012-0682.

8. ГОСТ Р 53022.2-2008 «Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 2. Оценка аналитической надежности методов исследования (точность, чувствительность, специфичность)» (утв. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии РФ от 18.12.2008 №555-ст).

9. EFLM Biological Variation Database. https://biologicalvariation.eu

10. Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов. Лабораторная служба. 2019; 8(2),36-44. DOI:10.17116/labs2019802136.

11. Jones G, Haeckel R, Loh T, Sikaris K, Streichert T, Katayev A et al. Indirect methods for reference interval determination – review and recommendations. CCLM. 2018;57(1):20-29. DOI:10.1515/CCLM-2018-0073.

12. Ozarda Y, Sikaris K, Streichert T, Macri J. IFCC Committee on Reference intervals and Decision Limits (C-RIDL). Distinguishing reference intervals and clinical decision limits – A review by the IFCC Committee on Reference Intervals and Decision Limits. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 2018;55(6):420-431. DOI:10.1080/10408363.2018.1482256. PMID:30047297.

13. CLSI Document EP09-A3. Measurement procedure comparison and bias estimation using patient samples. Third edition. Wayne, Pa., USA: CLSI; 2013.

14. Ozarda Y. Reference intervals: current status, recent developments and future considerations. Biochemia Medica. 2016;26(1):5-16. DOI:10.11613/BM.2016.001.

15. Coşkun A, Sandberg S, Unsal I, Cavusoglu C, Serteser M, Kilercik M et al. Personalized reference intervals in laboratory medicine: a new model based on within-subject biological variation. Clin Chem 2021;67(2):374-384. DOI:10.1093/clinchem/hvaa233.

16. Miller W, Horowitz G, Ceriotti F, Fleming J, Greenberg N, Katayev A et al. Reference intervals: strengths, weaknesses and challenges. Clin Chem 2016;62(7):916-923. DOI:10.1373/clinchem.2016.256511.

17. Harris E. Some theory of reference values. II. Comparison of some statistical models of intraindividual variation in blood constituents. Clin Chem 1976;22(8):1343-1350. PMID: 949844.

18. Cedul R, Hershey J, Williams S. Using multiple tests: series and parallel approaches. Clin Lab Med 1982;2(4):871-890. DOI:10.1016/S0272-2712(18)31018-7. PMID: 7160153.

19. Galen R, Gambino S. Beyond normality: the predictive value and efficiency of medical diagnoses. New York: John Wiley and Sons, 1975.

20. Coşkun A, Sandberg S, Unsal I, Yavuz F, Cavusoglu C, Serteser M, Kilercik M, Aarsand A. Personalized and population-based reference intervals for 48 common clinical chemistry and hematology measurands: a comparative study. Clin Chem 2023;69(9):1009-1030. DOI:10.1093/clinchem/hvad113.

21. Coşkun A, Plebani M. Reference intervals in value-based laboratory medicine: a shift from single-point measurements to metabolic variation-based models. Clin Chem Lab Med 2025;63(11):2140-2148. DOI:10.1515/cclm-2025-0763.

22. Plebani M. Multivariate approaches to improve the interpretation of laboratory data. Clin Chem Lab Med 2025;63(12):2153-2154. DOI:10.1515/cclm-2025-1071.

23. Архипкин А.А., Лянг О.В., Кочетов А.Г. Методика расчета референтных интервалов лабораторных показателей на примере фетальных белков. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2014; 3(47):23-25. УДК 681.5.09–616.074/078(035).

24. Ройтман А.П., Кузнецова Т.Е., Бугров А.В., Евгина С.А., Шустов В.В., Ламбакахар М.Г., Долгов В.В., Годков М.А. Концепция определения референтных интервалов на примере тиреоидной панели. Медицинский алфавит. 2025; (22):8-13. DOI: 10.33667/2078-5631-2025-22-8-13.

---

Скачать Лекцию 12